Telomerase-Hemmstoffe


Ein neuer Ansatz für die Behandlung maligner Tumoren

Ulrike Hartmann und Tim H. Brümmendorf, Tübingen

Ein detailliertes Verständnis der komplexen Regulationsmechanismen der Telomerase ist Voraussetzung für die Entwicklung klinisch-therapeutischer Anwendungen. Die Entwicklung von Telomerase-Inhibitoren ist ein völlig neues und viel versprechendes therapeutisches Prinzip zur Behandlung von malignen Tumoren, welches an einer wenn nicht der zentralen Schaltstelle des malignen Zellwachstums angreift. Im Moment fehlen aber noch klinische Studien, um den Erfolg des Therapieprinzips abschätzen zu können.
Arzneimitteltherapie 2003:21:176-85.

Telomere – Struktur und Funktion

Der Begriff Telomer, abgeleitet vom griechischen telos (Ende) und meros (Teil), wurde bereits 1938 von Hermann J. Müller geprägt.

Telomere setzen sich aus Desoxyribonucleinsäure (DNS) und verschiedenen Proteinen zusammen, unter anderem den so genannten Telomer-bindenden Proteinen wie TRF1 (telomeric-repeat binding factor 1) und TRF2 [1, 2]. Der Telomer-Nucleoproteinkomplex leistet einen wesentlichen Beitrag zum Schutz der kodierenden Bereiche des Chromosoms. Telomere sitzen gleichsam als nicht-kodierende „Kappen“ an den Chromosomen-Enden und schützen diese so vor enzymatischer Degradation, Rekombination und Fusion [3]. Außerdem dienen die Telomere als Anheftungspunkt der Chromosomen in der Kernmatrix [4], sind für die räumliche Anordnung von Telomeren und Chromosomen im Zellkern und für die Trennung der Chromosomen während des Zellzyklus verantwortlich.

Die DNS-Komponente der Telomere besteht aus sich wiederholenden Nucleotidbasen-Einheiten, wobei die Sequenz dieser „Repeats“ und ihre Länge von Spezies zu Spezies variiert. Beim Menschen und allen anderen Wirbeltieren (Vertebraten) lautet diese aus sechs Basen bestehende Sequenz (TTAGGG)n [5].

Im Gegensatz zur innerhalb der Vertebraten einheitlichen Sequenz der Nucleotide bestehen bei der Anzahl der Wiederholungen erhebliche Spezies-spezifische Unterschiede. Während der Mensch im Durchschnitt über einige Tausend Wiederholungen pro Chromosomen-Ende verfügt, findet man zum Beispiel in einzelnen Maus-Spezies oder in Katzen ein Vielfaches dieser Länge [6, 7]. Genauere Untersuchungen zeigten, dass die Länge der Telomere auch innerhalb einer Art, selbst innerhalb verschiedener Gewebe und sogar von Chromosomen-Arm zu Chromosomen-Arm [8] deutliche Unterschiede aufweist. Aufgrund der inkompletten Replikation der DNS im Bereich der Chromosomen-Enden, dem so genannten „End-Replikationsproblem“ [9, 10], kommt es bei jeder Zellteilung einer somatischen Zelle zu einer Verkürzung der Telomer-DNS der Tochter- gegenüber der Mutterzelle. Hieraus resultiert die Funktion der genfreien Telomer-DNS als Pufferzone zwischen Chromosomen-Ende und kodierenden Nucleotidsequenzen. Der replikationsabhängige Verlust an Telomer-Sequenz in somatischen Zellen wird auf 50 bis 200 Basenpaare (bp) pro Zellteilung geschätzt [11].

Bereits 1961 konnten Hayflick und Moorhead zeigen, dass somatische Zellen sich in Kultur nur für eine begrenzte Zeit teilen können, bevor sie in eine Art Ruhezustand, die so genannte Seneszenz, übergehen [12]. Die replikative Lebensspanne bis zum Erreichen dieses so genannten „Hayflick-Limit“ wird aber nicht durch die Expansionszeit in Kultur, sondern durch die Anzahl der durchlaufenen Zellteilungen determiniert (so genannte „replikative Alterung“). In vitro konnte gezeigt werden, dass sich primäre humane Zellen in Abhängigkeit vom Zelltyp etwa 50- bis 80fach teilen können, bevor sie das Hayflick-Limit erreichen und seneszent werden. Diese Zellen bleiben in diesem Zustand zwar vital und sind auch stoffwechselaktiv, doch haben sie die Fähigkeit verloren, sich weiter zu teilen. Seneszenz ist also keinesfalls mit Zelltod gleichzusetzen, sondern vielmehr mit einer Art postmitotischem Ruhestadium. Anfang der 90er Jahre wurde gezeigt, dass das Erreichen des Hayflick-Limits mit einer kritischen Telomer-Verkürzung verbunden ist (Abb. 1). Basierend auf seinen Arbeiten formulierte Calvin Harley 1991 das „Modell der mitotischen Uhr” somatischer Zellen, demzufolge die Telomer-Länge zum einen retrospektiv die replikative Vergangenheit einer Zelle widerspiegelt und zum anderen prospektiv deren Proliferationspotential limitiert [13].

Die unbegrenzte Proliferationsfähigkeit von malignen Tumorzellen ist mit dem durch das Hayflick-Limit [12] bedingten, begrenzten replikativen Potential somatischer Zellen nicht vereinbar. In der Tat verfügen Tumorzellen offensichtlich über Mechanismen, die es ihnen ermöglichen, das Hayflick-Limit zu überwinden. In der Mehrzahl der bisher untersuchten Tumorarten wurden verkürzte Telomere bei erhöhter Telomerase-Aktivität gefunden. Dies führte zu der Hypothese, dass Tumorzellen mit verkürzten Telomeren im Rahmen einer großen Zahl von Zellteilungen verschiedene genetische Veränderungen akkumulieren, wobei es vor Erreichen der „kritischen Telomer-Verkürzung“ zu einer Reaktivierung des Enzyms Telomerase kommt. Dieses Enzym ist in der Lage, dem fortschreitenden Telomer-Verlust dauerhaft entgegenzuwirken [14].

Telomerase und die Lösung des End-Replikationsproblems

Anfang der 80er Jahre gab es erste experimentelle Hinweise auf ein Enzym, das dem replikationsabhängigen Verlust der Telomer-„Repeats“ entgegenwirken kann. Wie auch schon bei der Entschlüsselung der Telomer-DNS konnte dieses als Telomer-Terminal-Transferase oder Telomerase bezeichnete Enzym zuerst in Wimperntierchen nachgewiesen werden [15]. 1989 entdeckte Morin erstmals Telomerase-Aktivität in einer humanen Tumorzelllinie [16]. Die Telomerase stellt einen Ribonucleoproteinkomplex dar, welcher neben der eigenen RNS-Komponente zwei Proteinuntereinheiten besitzt. Bis heute ist es noch nicht gelungen, die Struktur der humanen Telomerase, eines mehr als 300 kd großen Moleküls, vollständig aufzuklären. Bekannt ist bisher ihre Zusammensetzung aus einer 560 bp langen RNS-Matrize (hTR, human telomerase RNA) [17] und einer reversen Transcriptase, die als katalytische Untereinheit des Enzyms fungiert (hTERT, human telomerase reverse transcriptase) [18]. Die Matrize der RNS-Komponente (5’-CUAACCCUAAC)n der humanen Telomerase ist komplementär zur humanen Telomer-Sequenz (TTAGGG)n. Im Gegensatz zu hTERT, deren Expression vor allem in Keimzellen und malignen Zellen gefunden wird, wird hTR in allen bisher untersuchten Geweben ubiquitär exprimiert [17]. Neben diesen Molekülen wurden mehrere Telomerase-bindende Proteine identifiziert, wie zum Beispiel TP1 (telomerase associated protein 1) oder auch Dyskerin [19], welche die Aktivität des Enzyms modulieren (Abb. 2).

Die Synthese neuer Telomer-Repeats erfolgt vermutlich bereits vor Beginn der Replikation [20]. Die Telomerase nutzt dabei einen Teil ihrer RNS-Komponente als Matrize [16]. Diese Matrize besteht aus zwei verschiedenen Abschnitten, wobei der eine dafür zuständig ist, an das Telomer-Ende zu binden, während der andere als Vorlage für die Reverse Transcriptase dient, welche die DNS-Synthese übernimmt. Diese erfolgt in drei Schritten: Nach der Anbindung des Enzymkomplexes an die chromosomale DNS (sog. „Alignment“) werden die Telomer-Repeats (TTAGGG) an das Telomer-Ende synthetisiert (Elongation). Danach rückt der Enzymkomplex weiter (Translokation), wodurch eine neue Runde der Telomer-Synthese eingeleitet wird. Eine wichtige Kontrollinstanz der Elongation scheint dabei das Telomer-bindende Protein TRF1 zu sein. Ist TRF1 in einer Tumorzelllinie überexprimiert, erfolgt eine kontinuierliche Verkürzung der Telomere. Mutiertes TRF1, welches nicht mehr zur Telomer-Bindung fähig ist, führt andererseits zur unregulierten Telomer-Verlängerung [21].

Untersuchungen zeigen, dass der Mechanismus der Telomer-Regulation vermutlich komplexer ist, als ursprünglich angenommen. Während 90 % der Tumoren Telomerase-positiv sind, stabilisieren/verlängern die restlichen 10 % ihre Telomere auf andere Art und Weise. In Ausnahmefällen muss also von einem weiteren Mechanismus der Telomer-Verlängerung ausgegangen werden. Dieser weitere, Telomerase-unabhängige Mechanismus wurde erstmalig 1995 von Reddel et al. beschrieben [22] und als ALT pathway (alternative lengthening of telomeres) bezeichnet. Dem ALT-Mechanismus scheint nach dem gegenwärtigen Stand der Forschung allerdings bei Säugetieren gegenüber der Telomerase eine weitaus geringere Bedeutung zuzukommen.

Im Gegensatz zu malignen Tumorzellen kann in somatischen Zellen, vermutlich bedingt durch das Fehlen von Telomerase-Aktivität, in Abhängigkeit von der Anzahl der durchlaufenen Zellzyklen eine kontinuierliche Telomer-Verkürzung in vitro und in vivo beobachtet werden. In peripheren Blutleukozyten und hämatopoetischen Stammzellen konnten jedoch einige Arbeitsgruppen auf niedrigem Expressionsniveau Telomerase-
Aktivität nachweisen, welche etwa
1/10 der in Tumorzellen gefundenen Expression entspricht [23–25]. Vermutlich ist die geringe Expression nicht ausreichend, um dem stetigen Telomer-Verlust entgegen zu wirken. Bei Zellen, für welche der Erhalt der Telomer-Länge von Generation zu Generation hinweg essentiell ist, wie zum Beispiel Keimzellen, findet sich dagegen eine hohe Expressionsaktivität [26].

Untersuchungen an Mäusen, deren RNS-Komponente der Telomerase, mTR-/- (mice deficient for the mouse telomerase RNA), homozygot deletiert wurde („Knock-out-Mäuse“), verdeutlichen die Bedeutung der Telomerase für den Erhalt der Telomere [27]: Homozygote „Knock-out-Mäuse“ zeigten eine kontinuierliche Telomer-Verkürzung bis zum völligen Verschwinden der TTAGGG-Repeats. In späteren Generationen konnte in der Konsequenz eine Zunahme von End-zu-End-Fusionen (größtenteils so genannte Robertson-ähnliche Fusionen) beobachtet werden [28], wobei die Mäuse bis in die sechste Nachfolge-Generation lebensfähig blieben. Zu diesem Zeitpunkt zeigten diese Mäuse jedoch zunehmend Defekte in der Spermatogenese bis hin zur Infertilität, sowie neben Milzatrophie auch Störungen der Wundheilung, Immundefizienzen (insbesondere Defekte der B-Lymphopoese), sowie eine Reduktion der Knochenmarkreserve. Überraschenderweise fand sich eine gegenüber (Wildtyp-)Kontrolltieren deutlich erhöhte Tumorinzidenz und gesteigerte Apoptoseraten innerhalb des hämatopoetischen Systems [29].

In den letzten Jahren wurden die meisten malignen Tumoren des Menschen auf Telomerase-Aktivität hin untersucht. Dabei zeigt sich in der überwiegenden Mehrzahl der Tumoren eine hohe Enzymaktivität und im Vergleich dazu keine nachweisbare Aktivität im umliegenden Normalgewebe [30–33]. Das Enzym Telomerase und seine Hemmung durch neue therapeutische Strategien bieten neben der Nutzung des Enzyms als diagnostisch-prognostischem Faktor [34] einen neuartigen, kausalen und zudem Tumorentitäts-übergreifenden therapeutischen Ansatz zur Behandlung maligner Tumoren, der gegenwärtig weltweit intensiv bearbeitet wird.

Tumorbiologische Überlegungen und Perspektiven

Theoretische Überlegungen zu den Grenzen des klinischen Einsatzes von Telomerase-Inhibitoren ergeben sich zum einen daraus, dass sich nicht in allen malignen Tumoren Telomerase-Expression findet. Zum anderen könnte diese Therapie bei Tumoren mit relativ langen Telomeren bei Therapiebeginn möglicherweise erst nach einer Monate oder gar Jahre andauernden Latenzzeit zur proliferationsrelevanten Verkürzung der Telomere führen, da die Zelle zunächst ihr Replikationspotential aufbrauchen würde. Dies legt zumindest im metastasierten Stadium die Kombination von Telomerase-Inhibitoren mit konventionellen Therapiemodalitäten (Chirurgie, Bestrahlung, Chemotherapie) nahe, um eine Reduktion der Tumorlast zu erzielen, die den Substanzen die nötige Zeit zur Entfaltung ihrer antiproliferativen Wirkung gibt. Analog bietet sich die Therapie mit Telomerase-Inhibitoren bei minimaler Tumorlast, zum Beispiel im Sinne einer minimalen Resterkrankung (MRD), oder in einer adjuvanten (z. B. Hochrisiko-) Situation an. Es ist darüber hinaus möglich, Tumorzellen mit Telomerase-Inhibitoren für konventionelle Chemotherapien zu sensibilisieren. So berichteten Kondo et al. [35] von einer Steigerung der Sensitivität humaner Gliom-Zellen für die Cisplatin-induzierte Apoptose nach Telomerase-Inhibition in vitro durch stabile Expression einer anti-hTR-RNA. Ludwig et al. [36] zeigten einen gesteigerten apoptotischen Effekt von Topoisomerase-Hemmstoffen durch ein anti-hTERT-Ribozym. Alternativ wäre es unter den genannten tumorbiologischen Gesichtspunkten auch vorstellbar, zukünftig replikationsabhängige und -unabhängige Telomerase-spezifische Therapiestrategien zu kombinieren.

Potentielle Nebenwirkungen einer Therapiestrategie mit Telomerase-Inhibitoren betreffen eine Verkürzung der Telomere in Keimbahnzellen des Patienten. Dies könnte zur Folge haben, dass es im Falle von weiterbestehender Fertilität zu einer Verkürzung der Telomere bei den Nachkommen dieser Patienten käme. Außerdem könnten Telomerase-positive somatische Zellen, wie zum Beispiel aktivierte Lymphozyten oder hämatopoetische Stammzellen, in ihrer Proliferationsfähigkeit durch die Therapie mit Telomerase-Inhibitoren beeinträchtigt werden. Ein engmaschiges Telomer-biologisches Monitoring der behandelten Patienten ist erforderlich, um sowohl Effekte der Substanzen auf die krankhaft veränderte (im Fall von hämatologischen Neoplasien) als auch auf die normale Hämatopoese rechtzeitig erkennen zu können. Hierfür bieten sich insbesondere für den letztgenannten Aspekt quantitative FISH-Methoden (Flu-
oreszenz-in-situ-Hybridisierung) mit Telomer-spezifischen Fluoreszenz-markierten Sonden an [8, 37], die eine Durchfluss-zytometrische Quantifizierung der Telomer-Länge in gesunden [7, 38–40] wie auch erkrankten [41–43] hämatopoetischen Zellen erlauben.

Aufgrund der genannten Überlegungen ist die genaue Planung von klinischen Therapiestudien und die gründliche und kritische Erhebung präklinischer Daten an gut definierten und für solche Therapieansätze geeigneten Krankheitsmodellen von hoher Relevanz.

Ein Beispiel für ein solches Krankheitsmodell stellt neben den genannten Szenarien die chronisch myeloische Leukämie (CML) dar (Abb. 3). Über eine deutlich erhöhte Teilungsrate im malignen Stammzell-Kompartiment kommt es hier zu einer Verkürzung der Telomere im Laufe der chronischen, klinisch stabilen Phase (CP) der Erkrankung [41]. Bereits in der chronischen Phase sowie in zunehmendem Maß mit Fortschreiten der Erkrankung in die akzelerierte Phase (AP) und in die Blastenkrise (BC) findet sich eine deutlich erhöhte Telomerase-Aktivität in den Blutzellen der Patienten. In vivo überwiegt unter Telomer-biologischen Gesichtspunkten offensichtlich der Effekt des deutlich erhöhten zellulären Umsatzes („turnover“) gegenüber dem Effekt der erhöhten Telomerase-Expression, sodass es netto zu einer zunehmenden Telomer-Verkürzung im Verlauf der CP kommt. In wieweit es einen Zusammenhang zwischen progressiver Telomer-Verkürzung und der Induktion sekundärer chromosomaler Aberrationen beziehungsweise der Wahrscheinlichkeit der Akzeleration der Erkrankung gibt, wird gegenwärtig untersucht. Eine prospektive klinische Studie zur Klärung der Bedeutung der Telomer-Biologie für die Prognose und den natürlichen Verlauf der Erkrankung sowie deren Modifikation durch medikamentöse Therapien wie mit dem Tyrosinkinase-Inhibitor Imatinib (Glivec®) [44] wird gegenwärtig in Zusammenarbeit mit der Süddeutschen Hämoblastosegruppe von uns durchgeführt. Aus den Ergebnissen könnten sich Implikationen für den klinischen Einsatz von Telomerase-Inhibitoren bei dieser Krankheitsentität ergeben.

Im Folgenden wird auf die Literatur zu replikationsabhängigen und -unabhängigen Therapiestrategien im Einzelnen näher eingegangen.

Replikationsabhängige Therapiestrategien

Mit dem Ziel der Entwicklung neuer Telomerase-inhibitorischer Strategien werden verschiedene Angriffspunkte des Telomerase-Komplexes evaluiert. In den letzten Jahren wurden Telomerase-Inhibitoren in einer Vielzahl von Publikationen erwähnt. White et al. [45] erarbeiteten verschiedene theoretische Voraussetzungen für den Telomer-abhängigen, antiproliferativen Effekt einer Telomerase-hemmenden Substanz:

  • Der Inhibitor soll die Telomerase-Aktivität reduzieren, aber initial keinen Effekt auf die Zellwachstumsrate zeigen
  • Die Zugabe des Inhibitors soll mit jeder Zellteilung zu einer progressiven Verkürzung der Telomere führen
  • Die Zugabe des Inhibitors soll nach (längerer) Therapie Apoptose oder Wachstumsarrest hervorrufen
  • Die Behandlungsdauer bis zum Einsetzen eines Proliferations-hemmenden Effekts soll direkt mit der initialen Telomer-Länge korreliert sein
  • Substanzen, die keine Reduktion der Telomerase-Aktivität bewirken, sollen auch keine verringerte Zell-Proliferation oder Telomer-Verkürzung bewirken

Nur wenige der in bislang erschienenen Veröffentlichungen beschriebenen Substanzen erfüllen diese Kriterien. In der folgenden Übersicht werden ohne Anspruch auf Vollständigkeit einige Ansatzpunkte für Telomerase-Inhibitoren und die daraus resultierenden Möglichkeiten vorgestellt.

Angriffspunkt: Telomerase – die katalytische Untereinheit hTERT

Nucleosid-Analoga und andere katalytische Inhibitoren

Die überzeugendsten Ergebnisse lieferte die Einführung dominant-negativer hTERT-Mutanten in menschliche Krebszellen [46]. Neben Telomer-Verkürzung fand man nach kontinuierlichen Passagen in vitro auch Seneszenz und Apoptose der Zellen. Dieser Ansatz ist bislang In-vitro-Strategien vorbehalten, dient aber als so genanntes „proof of principle“ für die im Folgenden dargestellten Strategien.
Unspezifische Reverse-Transcriptase-Inhibitoren. Reverse-Transcriptase-Hemmer werden vorwiegend in der HIV-Therapie verwendet. Die nucleosidalen Reverse-Transcriptase-Inhibitoren blockieren die virale Reverse-Transcriptase, sodass es zu einem Kettenabbruch bei der Synthese von proviraler DNS kommt. Beispielhaft für die hemmende Wirkung auch der katalytischen Untereinheit der Telomerase (hTERT) sei hier Azidothymidin (AZT) erwähnt [47, 48]. AZT ist allerdings nicht Telomerase-spezifisch. Das aktive Analogon ist ein genereller Inhibitor von Polymerasen. Trotzdem konnte die Effektivität und dosisabhängige, reversible Hemmung der Telomerase in vitro nachgewiesen werden [49]. In Untersuchungen zur Wirkung von AZT auf gesunde, humane Lymphozyten ergab sich kein Hinweis auf direkte Zytotoxizität, sondern eine reversible Unterdrückung des Zellwachstums [50].
Post-translationale Modifikationen. Modifikationen, wie zum Beispiel Phosphorylierungen, spielen eine große Rolle in der Regulation von Enzymaktivitäten. Phosphorylierung der Telomerase durch Proteinkinase C (PKC) führt zu einer Steigerung der Aktivität, während eine spezifische Hemmung der PKC, wie zum Beispiel durch Antisense-mRNA, die Aktivität der Telomerase hemmen kann [51]. Ein Problem dieses Ansatzes stellt allerdings die Spezifität der Hemmung der Telomerase-Phosphorylierung dar, ohne mit der Phosphorylierung anderer physiologisch relevanter PKC-Targets zu interferieren.
„Small Molecules“. Einen großen Fortschritt in der Entwicklung neuer, selektiver Telomerase-Inhibitoren wurde durch das Screening verschiedener „Small-molecule“-Substanzen gegen Telomerase-haltige Kernextrakte erreicht. Diese Stoffe (z. B. BIBR 1532) [52] erfüllen die genannten theoretischen Anforderungen an einen Telomerase-Inhibitor, das heißt, sie zeigen keinen Effekt auf das kurzzeitige Überleben oder das Wachstum der Zellen und bewirken eine replikationsabhängige Verkürzung der Telomere in Krebszellen. Eine Hemmung des Zellwachstums wurde erst nach einer bestimmten Zeitperiode in Telomerase-positiven Zellen, unabhängig vom p53-Status der Zellen, festgestellt. Das Potential dieser Stoffe konnte auch im Tumor-Xenotransplantat-Modell nachgewiesen werden. Ein weiterer Vorteil besteht in der oralen Bioverfügbarkeit der Substanz, was in Anbetracht der zu erwartenden Einnahme im Sinne einer „Dauertherapie“ von besonderer Bedeutung ist.

Hemmung der Transkription

Eine attraktive Methode, neue Tumortherapien zu entwickeln, stellt die therapeutische Beeinflussung der Transkription krebsassoziierter Gene dar. Dabei wird entweder die Aktivität des hTERT-Promotors direkt unterdrückt oder die Expression relevanter Regulationsmoleküle behindert [53].

Trotz eines bekannten karzinogenen Effekts erwies sich Arsentrioxid [54] als potenter Inhibitor der hTERT-Transkription. Bei einigen Leukämie-Arten, wie der akuten Promyelozyten-Leukämie (APL), beweist Arsentrioxid gute Wirksamkeit. Inwiefern neben der Differenzierungs-induzierenden Wirkung auch davon unabhängige Telomer-biologische Effekte hierfür von Bedeutung sind, ist gegenwärtig unklar.

Eine alternative Methode, mit der Telomerase-Expression zu interagieren, ist die Modulation von Transkriptions-interagierenden Signalwegen. Die Beeinflussung der Telomerase-Aktivität ist durch eine Vielzahl an Hormonen möglich. Retinoide, zum Beispiel, zeigen eine Hemmung der hTERT-mRNA und damit der Telomerase-Aktivität vermutlich als Folge der Induktion einer Ausdifferenzierung von Leukämiezellen [55]. Für Estrogene und Androgene dagegen wurde ein aktivitätssteigernder Effekt beschrieben [56]. Der Partialagonist Tamoxifen konkurriert mit Estrogen um die Bindung am Estrogen-Rezeptor. Aldous et al. konnten entsprechend eine Hemmung der Telomerase-Aktivität einer humanen Brustkrebszelllinie durch Tamoxifen nachweisen [57]. Auch hier ist die Bedeutung der Telomerase-Hemmung für die antiproliferativen Effekte der Substanz bislang offen.

Angriffspunkt: Telomerase – die RNS-Komponente hTR

Antisense-Strategien

Weitere Ansätze zielen auf eine Hemmung der RNS-Untereinheit hTR mittels Antisense-Strategien [58]. Die Instabilität von RNS-Molekülen bei der Verabreichung als Medikament stellt dabei eines der grundsätzlichen Probleme dieser Therapie-Strategie dar. Es wurden jedoch Modifikationen entwickelt, die eine Stabilisierung der RNS erlauben. Einige dieser modifizierten Oligonucleotide gingen in Anti-Telomerase-Studien ein [59]. Hier ruhen die Hoffnungen insbesondere auf RNS-Analoga wie den 2’-O-MeRNA und den so genannten Peptid-Nucleinsäuren (PNA).

2,5-A-Oligonucleotide. Antisense-Oligodesoxynucleotide (ODN) bestehen aus einem kurzen DNS-Stück komplementär zur Ziel-RNS. Nach ihrer Hybridisierung mit der hTR-RNS bewirken sie nicht nur eine Hemmung der RNS-Funktion, sondern auch eine direkte Hemmung der Telomerase-Aktivität. Schon vier bis fünf Tage nach Behandlung kommt es in Zellkulturen zur massiven Apoptose. Da Apoptose nach dieser kurzen Zeitspanne nicht auf eine Verkürzung der Telomere zurückgeführt werden kann, wird diese Reaktion mit der Aktivierung von RNAsen und damit dem Abbau der RNS erklärt. Der Transport der ODNs in die Zelle stellt allerdings ein Problem dar. In vivo überwinden sie die Zellmembran durch Endozytose, werden aber in der Zelle sehr schnell durch Nukleasen abgebaut. Chemische Modifikationen reduzieren zwar die Empfindlichkeit gegenüber den abbauenden Nukleasen, dezimieren aber auch die Bindungsspezifität. Die Verwendung von 2’,5’-Oligoadenylat-(2,5-A-)Oligonucleotiden steigert die Aktivität der ODNs gegen die Telomerase [60, 61]. Nach der Hybridisierung mit der RNS werden spezifische RNAsen an die 2,5-A-Struktur gebunden, aktiviert und spalten nun die Ziel-RNS. Kondo et al. [62] behandelten, wie schon kurz erwähnt, maligne Gliom-Zellen mit dieser Therapie-Strategie und konnte schon fünf Stunden nach der Behandlung keine hTR (durch RT-PCR) mehr nachweisen. Nach längerer Inkubationszeit war ein Großteil der Zellen apoptotisch. Kushner et al. beschrieben einen ähnlichen Effekt der (2,5-A-)Antisense-ODS gegen hTR in humanen Ovarial-Zelllinien [61].
Peptid-Nucleinsäuren (PNA). Eine weitere Klasse der Oligonucleotide sind die Peptid-Nucleinsäuren (PNAs) [63]. PNAs sind Analoga der RNS/DNS, in welchen das Pentosephosphat durch ein Oligomer [N-(2-aminoethyl)-glycin] ersetzt wurde. Durch diese strukturelle Modifikation werden die Resistenz gegen Nucleasen und die Spezifität und Affinität zur Target-RNS hTR erhöht. Nachdem spezifische PNA in humane, immortalisierte SV-40-Zellen transfiziert wurde, zeigten die Zellen schon nach relativ kurzer Kultivierungszeit reduzierte Telomerase-Aktivität, verkürzte Telomere und Wachstumshemmung [64].
Phosphorothioate Oligodeoxynucleotide – Antisense-hTR-RNA. Im Gegensatz zu den PNAs hemmen die stabilisierten PS-ODS (Phosphorothioate Oligodeoxynucleotide) die Telomerase-Aktivität schon bei subnanomolaren Konzentrationen und sind somit effizienter. Durch den Austausch eines Sauerstoffatoms einer Nucleinsäure-Phosphatgruppe durch ein Schwefelatom, ist das Molekül gegen enzymatischen Abbau geschützt. In der Studie von Matthes et al. [65] konnte die direkte Interaktion der PS-ODS mit der Primer-Bindungsstelle der hTERT nachgewiesen werden, was diese Substanzen unabhängig von der Sequenz der RNS macht. Die Modifikation der Länge dieser Moleküle wirkt sich stärker auf die Wirksamkeit der PS-ODS aus als eine Änderung der Sequenz, was die nicht sequenzspezifische Wirkungsweise unterstreicht. Mata et al. [66] untersuchten PS-ODS an Burkitt-Lymphom-Zellen. Dabei stellten sie eine Hemmung der Telomerase-Aktivität, eingeschränkte Proliferationsfähigkeit der Zellen und zunehmende Apoptose fest. Neben diesen In-vitro-Daten war auch in vivo, im Tiermodell, eine deutliche Reduktion des Tumorwachstums nachweisbar.

„Hammerhead“-Ribozyme

Als Ribozym wird eine Klasse von RNS-Molekülen bezeichnet, welche durch ihre Endoribonuclease-Aktivität in der Lage sind, die Phosphodiesterbindung der RNS zu spalten. Ein Beispiel hierfür sind „Hammerhead“-Ribozyme, so genannt wegen ihrer spezifischen Y-förmigen Struktur. Sie bestehen neben der katalytischen Einheit aus einer RNS-Sequenz [67] komplementär zur Zielstruktur hTR. Diese kurzen RNS-Moleküle erkennen die spezifischen Trinucleotid-Sequenzen, vorwiegend GUC, und spalten die Ziel-RNS an dieser Stelle. Verschiedene Studien, wie die von Yokohama et al. [68], konnten die Hemmung der Telomerase-Aktivität und nach einer gewissen Latenzphase, die Telomer-Verkürzung in vitro nachweisen. Folini et al. [69] fanden dagegen keine Effekte auf die Länge der Telomere. Der Einfluss der hTR-Hemmung auf die Zell-Proliferation oder Telomer-Längen-Regulation bleibt weiter unklar.

Neben hTR bietet auch hTERT Sequenzen für einen Angriff der Ribozyme [70]. Während Moleküle gegen das 5’-Ende der hTERT in der Lage sind, hTERT-mRNA zu spalten und durch die erschwerte Translation eine messbare Telomerase-Hemmung zu induzieren, bewirkten Ribozyme gegen das so genannte T-Motif (beteiligt an der Interaktion hTR – hTERT), eine Telomer-Verkürzung und gesteigerte Apoptoseraten [36].

Replikationsunabhängige Therapiestrategien

Angriffspunkt: Telomer

Telomere in Assoziation mit Telomer-bindenden Proteinen spielen, wie schon erwähnt, eine essentielle Rolle beim Schutz der Chromosomen-Enden vor Fusion oder DNS-Schäden. Diese Schutzkappe bietet eine weitere Möglichkeit, Telomerase-positive Zellen gezielt und spezifisch, aber unabhängig von der jeweiligen Ausgangs-Telomer-Länge anzugreifen [71, 72].

Mutierte hTR-RNAs. Expression mutierter hTR-RNA induziert die Synthese mutierter Telomere und führt dadurch zur Reduktion des Zellwachstums in vitro [73]. In neueren Studien wurde die Expression mutierter hTR-RNAs an Brust-, Prostatakarzinomzellen und im Mausmodell untersucht. Werden Telomere mit solchen mutierten Sequenzen verlängert, wird die Bindung DNS-sequenzspezifischer Proteine (wie TRF1 oder TRF2) gestört, was unweigerlich zum „uncapping“ der Chromosomen führt. Folgen sind Zellzyklusarreste und abnehmende Zellwachstumsraten bis hin zur Apoptose [71]. Dabei kommt es weder zur Verkürzung der Telomere, noch zu einer Hemmung der endogenen Telomerase-Aktivität. Der Angriff am Telomer-Ende könnte einen effektiveren und schnelleren Weg als die klassische Methode der Telomerase-Hemmung darstellen. Allerdings ist es schwierig, eine ausreichende Spezifität für Karzinomzellen zu erreichen. Die Gefahr des Angriffs an der Telomer-Struktur normaler Gewebezellen und der daraus resultierenden unakzeptablen Toxizität ist ein großer Nachteil dieser Methode.

G-Quadruplex-Stabilisatoren. Die Identifizierung weiterer Substanzen mit dem Angriffsziel Telomer ist also von beträchtlichem Interesse. Eine solche Angriffsmöglichkeit bietet der kurze, Guanin-reiche Einzelstrang-Überhang am Telomer-Ende [74]. In vitro kann er eine quartäre DNS-Struktur, das so genannte G-Quadruplex, bilden. Vermutlich trägt diese Struktur, falls sie in vivo existiert, zur Schutzkappenfunktion der Telomere und zur Hemmung der Telomerase-Aktivität bei [75–77]. Substanzen, welche in der Lage sind, diese G-Quadruplex-Struktur zu stabilisieren, könnten demnach möglicherweise antiproliferative Effekte ausüben. Inzwischen wurde über eine Reihe von wirksamen Substanzen berichtet, welche das G-Quadruplex in Zellkulturen und Zellextrakten stabilisieren können. Zu diesen Stoffe gehören: Porphyrinderivate, Acridine, 2,6-Diaminoanthrachinone und Fluorenon-haltige Substanzen [75, 78–80]. Obwohl dieser Ansatzpunkt eine entwicklungsfähige Möglichkeit der Telomerase-Hemmung sein könnte, konnte noch in keiner der publizierten Arbeiten eine tatsächliche Verkürzung der Telomer-Länge durch diese Stoffe nachgewiesen werden.

Gentherapeutischer Ansatz mit Hilfe des Telomerase-Promotors

Die bisher angesprochenen Therapie-Strategien haben vorwiegend als Ziel, die Telomerase-Aktivität zu hemmen. Sie beeinträchtigen entweder direkt oder indirekt die Bindung der Telomerase an die Telomere. Allerdings wirkt die pharmakologische Hemmung der Telomerase nicht sofort zytotoxisch auf Tumorzellen, ein Phänomen, das als ‚phenotypic lag’ bekannt ist. Die klassische Wirkung der Telomerase-Inhibitoren beruht auf der Wiederherstellung der kontinuierlichen Verkürzung der Telomere mit jeder Zellteilung. Nach dem Unterschreiten der kritischen Telomer-Länge signalisieren die kurzen Telomere der Zelle, Seneszenz- oder Apoptose-Programme einzuleiten. Während der Therapie wird allerdings das Tumorvolumen zunächst weiter wachsen. Eine alternative Strategie nutzt die Telomerase-Expression in malignen Geweben, um zytotoxische Moleküle tumorspezifisch zu aktivieren, wo sie ihre Wirkung Telomer-unabhängig entfalten können. Ein essentielles Charakteristikum dieser Therapiestrategie ist die Möglichkeit, Tumorzellen spezifisch anzugreifen, während gesundes Gewebe, mit wenigen Ausnahmen, wie zum Beispiel Keimbahnzellen, nicht beeinflusst wird. hTR- und/oder hTERT-Promotoren ergeben eine Vielzahl an exzellenten Angriffspunkten für derartige Therapiestrategien [81].

Aktivierung von Prodrugs. Plumb et al. untersuchten die Möglichkeit, mit Hilfe des Promotors des hTR und/oder der hTERT die Expression der bakteriellen Nitroreduktase zu regulieren. Nach Transfektion des bakteriellen Nitroreduktase-Gens in die Zelle wird der hTR- und/oder hTERT-Promotor zur Kontrolle der Nitroreduktase-Expression genutzt. Dieses Enzym ist nun in der Lage, das Prodrug CB1954 in seine aktive Form zu überführen. Nach der Aktivierung entfaltet die Substanz ihre zytotoxischen Eigenschaften, führt als Alkylans zur Quervernetzung der DNS und löst damit in teilungsaktiven und ruhenden Zellen Apoptose aus. So führt CB1954 schon nach einmaliger Gabe zu einer Reduktion der Tumormasse im Xenograft-Modell [82]. Da allerdings Tumorzellen mit geringer Promotor-Aktivität nicht angegriffen werden, limitiert dies den Gebrauch der neuen Therapie-Option.
Transporter für radioaktive Pharmaka. Radioaktive Bestrahlung stellt eine der wirksamsten Möglichkeiten zur Behandlung maligner Tumoren dar. Allerdings wird die klinische Anwendung der Bestrahlung zur Behandlung von Krebspatienten durch die Schädigung des benachbarten normalen Gewebes limitiert. Strategien, welche es möglich machen, die Strahlen-Belastung des normalen Gewebes (bei voller Exposition des Tumorgewebes) zu minimieren, sind Gegenstand intensiver Forschung [83]. Eine vielversprechende Möglichkeit nutzt die Transkription spezifischer Transporter-Gene in Tumorzellen, um die selektive Aufnahme radioaktiv markierter Medikamente in diesen Zellen zu ermöglichen. Boyd et al. nutzten den hTR-Promotor, um Noradrenalin-Transporter-Gene (NAT) in Gliom-Zellen zu exprimieren [84, 85]. Durch die Expression dieser NAT-Gene wurde die aktive Aufnahme des radioaktiven [131I]Metaiodobenzylguanidins (MIBG) und damit die Apoptose der Gliom-Zelle durch ihre strahlungsbedingte Schädigung induziert.
Aktivierung von Suizid-Genen. Möglich ist auch die Nutzung des hTR- und hTERT-Promotors zur Regulation einiger Suizid-Gene. Mehrere Studien untersuchten die Effekte der auf Tumorzellen beschränkten Expression verschiedener Apoptosefaktoren, wie Caspase-8 [86], Bax [87] und FADD (Fas-associated protein with death domain) [88]. Durch die Induktion dieser Faktoren konnte in einigen Tumorzelllinien in vitro Apoptose ausgelöst werden, die in normalen, gesunden Zellen nicht auftrat. Auch die Tumortherapie im Xenograft-Modell zeigte eine signifikante Reduktion der Tumormasse. Eine weitere Möglichkeit ist die hTR- und hTERT-Promotoren-vermittelte Expression des Diphtherie-Toxin-A-Gens, welches ebenso nachweisbar zur effektiven Tötung von Tumorzellen führt [89].

Immuntherapie

Mit großem Interesse wird gegenwärtig die Entwicklung auf dem Feld der zellulären Immuntherapie maligner Tumoren verfolgt [90–92]. Hierbei kann die Immunantwort mittels autologer antigenpräsentierender Zellen (APCs), wie Makrophagen oder dendritischer Zellen, durch Manipulationen ex vivo für ausgewählte Zielstrukturen verstärkt werden. Durch die APCs werden Peptidsequenzen der Antigene prozessiert und zum endoplasmatischen Retikulum transportiert. Dort interagieren sie mit dem MHC (major histocompatibility complex). Die antigenbeladenen MHC präsentieren das Peptid an der Zelloberfläche, wo es von zytotoxischen T-Zellen (CTL) erkannt wird. Einige der Peptidsequenzen des hTERT-Proteins können ebenfalls prozessiert und MHC-abhängig präsentiert werden [93]. Dies kann für die Ex-vivo-Manipulation von autologen APCs zur Erzeugung einer Antitumor-Immunantwort verwendet werden. Die gewonnenen anti-hTERT-spezifischen zytotoxischen T-Zellen sind nun in der Lage, hTERT-positive Tumorzellen zu lysieren, während somatische Zellen nicht angegriffen werden. Interessanterweise fand keine der bisher durchgeführten Studien eine Immunantwort gegen CD34+-hämatopoetische Stammzellen [91] trotz der in diesen Zellen nachweisbaren Telomerase-Aktivität. Grund dafür stellt wahrscheinlich das niedrige Expressionsniveau und die diskontinuierliche Telomerase-Expression in diesen Zellen im Vergleich zu Tumorzellen dar. Phase-I-Studien in den USA zeigen bisher keine gravierenden Nebenwirkungen und vor allem auch keine Knochenmarkstoxizität [94], eine Phase-II-Studie am National Cancer Institut (NCI) ist gegenwärtig im Gang.

Weitere Ansätze

Eine zuletzt publizierte Studie von Seimiya [95] beschrieb die Neusynthese einiger synthetischer Phenylderivate auf Grundlage des Epigallocatechingallats (EGCG), einem Catechin aus Tee-Extrakten. Kontinuierliche Behandlung einer monoblastoiden Leukämie-Zelllinie resultierte in einer Hemmung der Telomerase-Aktivität, Verkürzung der Telomere und Wachstumshemmung der Zellen. Der genaue Mechanismus der Telomerase-Hemmung ist allerdings noch nicht bekannt.

Ausblick

Ein detailliertes Verständnis der komplexen Regulationsmechanismen der Telomerase ist Voraussetzung für die Entwicklung klinisch-therapeutischer Anwendungen. Obwohl Telomerase-abhängige Therapien eine theoretisch erfolgversprechende, neue tumorbiologische Therapie-Strategie darstellen, kann der Stellenwert dieser Therapiemodalität aufgrund fehlender klinischer Studien in gut ausgewählten klinischen Modellsituationen zum heutigen Zeitpunkt jedoch noch nicht abgeschätzt werden.

Zusammenfassend stellt die Entwicklung von Telomerase-Inhibitoren ein neues und viel versprechendes therapeutisches Prinzip zur Behandlung von malignen Tumoren dar, welches an einer, wenn nicht der zentralen Schaltstelle des malignen Zellwachstums angreift.

Danksagung

Wir danken Dr. Stefan Balabanov für die kritische Durchsicht des Manuskripts, Dr. Hans-Peter Lipp, Prof. Dr. Carsten Bokemeyer und Prof. Dr. Lothar Kanz für stete wissenschaftliche Diskussionsbereitschaft und die Unterstützung unserer Arbeiten.

Unterstützt durch die Deutsche Krebshilfe (Projekt-Nummer: Br 70–2746) und die Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG (Teilprojekt A6 des Sonderforschungsbereich 510)

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Für die Verfasser:
Dr. med. Tim H. Brümmendorf, Medizinische Universitätsklinik II, Abteilung Hämatologie und Onkologie, Otfried Müller Str. 10, 72076 Tübingen, E-Mail: tim.bruemmendorf@med.uni-tuebingen.de

Abb. 1. Die Telomer-Hypothese der zellulären Alterung

Abb. 2. Telomere, Telomerase und deren Bindungspartner in Vertebraten

Abb. 3. Modell zur Telomer-Biologie bei der chronischen myeloischen Leukämie unter Behandlung mit Telomerase-Hemmstoffen

Arzneimitteltherapie 2003; 21(06)